【SOP】最完整的革兰染色标准操作规程

革兰染色SOP

找不到说明书了，没关系，我把革兰染色的SOP（标准操作规程）分享给大家。。。

原理

细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在Gˉ细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。

试剂组成

龙胆紫液、碘溶液、脱色液、沙黄溶液

方法

1.1 涂片：用加样枪或接种环取少量无菌生理盐水与洁净玻片上，然后用接种环取少量菌落与生理盐水混匀制成薄而均匀的涂片，其余标本涂片见各标本处理步骤

1.2 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰

1.3  固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色

1.4 染色

1.4.1 加结晶紫染色10秒，之后水洗、甩干

1.4.2 加碘溶液染色10秒，之后水洗、甩干

1.4.3 加脱色液脱色10-20秒，之后水洗、甩干

1.4.4 最后加沙皇染液复染10秒，之后水洗、甩干

用滤纸吸干或在空气中晾干后，在涂菌处滴加一滴香柏油镜检

结果判定

1.1 革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色

1.2 报告：革兰染色找到革兰阴性和/或阳性球菌和/或杆菌（排列情况，形似××菌）或真菌孢子和/或菌丝

质量控制

用标准菌株大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923混合染色，以检测染液的质量和操作者技术。

注意事项

1.1 染色结果常受操作者影响，尤其是容易过度染色，往往革兰阳性菌染成革兰阴性菌

1.2 涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度

1.3 菌落以18-24小时新鲜菌落为佳，陈旧性标本涂片易产生假阴性

当酒精的浓度为70% 时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌，所有为防止酒精浓度下降，每次用完酒精后立即盖住瓶口。