肌酐异常探究竟，论生化曲线的重要性

前   言

生化仪对整个反应过程发生的吸光度变化进行记录并形成相应的曲线，观察反应曲线的形状、走势等特点，可以帮助我们直观地分析检测的反应过程, 快速锁定异常值发生的原因，给临床的诊断和治疗提供最可靠的结果。本文就通过一生化曲线而找到肌酐结果异常原因的案例，记录如下：

案例经过

突发情况总在忙碌工作时出现，让人猝不及防。某日下午审发报告时，一例体检肌酐负值结果（- 103.2umol/L）赫然出现在眼前，却没有收到仪器的提示报警声音。找出该样本查看情况，条码信息：患者男，62岁，为站点体检人群。

根据实验室质量管理制度，立即展开排查：

一、检查标本状态：

1．样本：血清淡黄清亮，无脂血、溶血、黄疸、漂浮物等异常状态，样本量充足。

2．试剂：有效期内使用，放置正确。

3．仪器：正常运转，无报警信息；

4．质控：当天室内质控在控，且在较长时间段内稳定（同批号质控品、同批次试剂）

5．此样本的其他项目和同批次上机的其他样本均无异常情况，排除采样针、管道堵塞。翻查仪器日常保养记录，显示一切正常。每天早上开机前均先擦拭样本针、搅拌杆，清洗机构，并冲洗针管内外壁后再上标本检测。每个星期做一次液路、反应杯深度清洁，光源灯检测。这些基本排除了因采样针堵塞而造成少吸或空吸的情况。

二、反应曲线中找到关键信息：

那么，这个样本的肌酐为什么会出现负值？查看曲线，有所发现：

图 1

测试所用的仪器为迈瑞BS830全自动生化分析仪，原厂试剂，肌氨酸氧化酶法。从图1负值的反应曲线可得出以下信息：

1．此肌酐分析方法为终点法，方向为上升反应。采光周期共33个点。

2．在采光点5加入血清，混匀后，副波长随即抬高，吸光度变化明显，此为反应系统中有干扰情况。而在正常反应中，R1+S段的曲线应该是平直、无跳点、不反应的。

3．在采光点17加入R2试剂，混匀后，继续反应，直到平衡状态。可见用于计算的第二采光区间（31-33）（R1+S+R2）的吸光度小于第一采光区间（14-16）（R1+S）的吸光度，按浓度公式计算，必然导致最终仪器的结果为负值。

三、尝试稀释和更换试剂解决问题：

为了排除偶然误差，继续复查原样本。再用生理盐水稀释成不同倍数的样本，分别用不同批号的试剂进行测试对比，并同步检测尿素，以备观察分析。结果显示，稀释前后，尿素结果较为一致；但肌酐值却不理想，在加入R2试剂前的吸光度仍然比加入后的吸光度要高，原液的复查结果依旧是负值。不同批号试剂的测试结果与稀释倍数不成比例，可见稀释样本和更换试剂的做法并不能排除干扰 。（图2）

四、进一步查因，确定干扰物的存在：

将血清分装，上送到健共体总医院实验室进行复核。（日立全自动生化分析仪，科方试剂，肌氨酸氧化酶法）。（图3、4）

图3

图4

如图所示，肌酐结果为72umol/L，稀释5倍后是83umol/L。截图清晰地显示了在加入R2前的这段反应曲线仍有明显抬高现象，提示反应过程中同样存在干扰。至此，初步锁定是标本自身存在干扰成分。

五、药物所致？

这种干扰物会是什么呢？带着这个疑问，赶紧联系站点医生了解患者病情。得知此人为社区在管的高血压患者，常年服用降压药，并伴有慢性鼻炎、失眠。患者在抽血前两天咽喉不适，出现咳嗽，医生开具止咳药物。之后患者感觉病情改善不大，便在药店自行购买中成药服用。（图 5）

图 5

难道是药物导致的异常结果？查找相关文献资料，在常见的对肌酐检测造成负干扰的药物中，包括了羟苯磺酸钙[1]、维生素C、安乃近、N-乙酰半胱氨酸、酚磺乙胺等（图 6）[2] ，但患者均否认服用或注射过上述药物，且并亦未找到因降压药而导致肌酐检测负值的相关资料。

图6

六、球蛋白中找到线索：

本着不放过任何一个疑点的原则，再次仔细审查患者的其他检查结果，果然发现了点端倪。在患者的肝功能报告中，提示总蛋白81.9g/L，球蛋白42.3g/L，白蛋白/球蛋白为0.9，球蛋白稍高一些，会不会是这个原因呢？为了验证猜测，尝试将R1试剂与血清按1:1、3:1的比例分别混匀后离心，发现3:1的管底有少量沉淀产生（图7-8）。据文献报道，一种异常免疫球蛋白--M蛋白会干扰肌酐酶法试剂的检测[3]。

图（7-8）

果不其然！于是迅速与临床医生进行沟通，为患者开具肾功能、血清蛋白电泳和固定电泳检查项目，外送到合作的第三方检验机构检测，并告知对方实验室此患者肌酐负值的情况。第二天结果回报，采用罗氏和日立两种品牌生化仪器检测的肌酐反应曲线都都提示存在干扰 。随着稀释倍数增大 ，反应曲线趋于正常，但稀释倍数与结果并不成比例，真实性无法保证，但佐证了原结果负值为干扰所致。

再看血清蛋白电泳(⽑细血管)结果，γ-球蛋白升高，占31.2%，血清免疫固定电泳(DYIF)的结果提示为单克隆免疫球蛋白IgM-k型，至此，真相终于浮出水面！（图9-10）

图9-10

随后经临床医生综合分析，患者需要进一步完善外周血、骨髓细胞形态等其他相关检查才能确诊，遂建议患者到上级医院检查。

案例分析

1．球蛋白异常是肝脏疾病、免疫系统受损的非直接表现。球蛋白通常分为 A、G、M、D、E五类 ，M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖所产生的一种大量的异常免疫球蛋白。最常见于多发性骨髓瘤(MM)中，约占血液系统恶性肿瘤的10%[4]。M蛋白干扰酶法肌酐检测的主要原因在于M蛋白在不同缓冲体系和离子强度等条件下的溶解状态不同，形成沉淀析出后，引起浊度变化，干扰比色检测，造成空白吸光度升高而导致结果假性偏低甚至负值。此案例中，肝功能只有球蛋白稍微升高，指向性不明显，稍不留意，便有可能造成漏诊。据资料分析，干化学法检测肌酐较湿化学法具有优势，其采用多涂层薄膜技术，样本先通过扩散层再到反应层，可有效滤去大分子的干扰物质[5]。还可通过聚乙二醇PEG6000沉淀法降低免疫球蛋白在反应中的影响[6]。

2．肌酐是肌酸代谢的终末产物，由磷酸肌酸通过脱磷酸基而形成的一种物质。血中肌酐的浓度主要与肾小球滤过率相关，是评价临床肾功能的重要指标。酶法检肌酐采用双波长，副波长主要用于消除样本、试剂的干扰。文献报道，M蛋白对不同品牌试剂、不同仪器性能影响不一，可出现正、负干扰。倍数稀释法难以消除M 蛋白干扰，且随着稀释倍数增加，M蛋白的干扰作用虽然会逐渐减弱，但可能存在误差，稀释法结果的可靠性除了关乎取样的准确性，还有线性范围和稀释倍数间关系[7]，同时也需要考虑稀释介质的基质效应，不可控因素太多。

3．反应曲线是生化反应过程的记录，通过查看反应曲线可以帮助我们判断检测结果是否准确、存在干扰、光源是否稳定、采样针是否堵塞、清洗机构有没故障等问题[8]。对保证检验结果准确性提供了有力保障。通过分析反应曲线，有利于发现常规不易发现的问题。但也有反应曲线所不能反应的问题，如加入试剂或样本量少等引起结果异常时反应曲线并无明显异常，此时就需要通过其他途径及时发现问题。

总    结

1．MM在检验过程中多见于中老年人。由于早期临床症状改变不明显，缺乏特异性，后期出现的发热、腰腿疼痛 、肾功能不全等容易被误诊而延误病情。因此，社区范围内提高对此病的监测尤为重要。

2．社区医疗机构资源有限，在检验过程中遇到问题，超出硬件范围许可时，应及时向上级单位或第三方检验机构寻求帮助。社区慢性病患者中老年人占很大比例，基础病以高血压、糖尿病常见。社区医院医生、护士在为患者提供基本医疗服务时，若能仔细关注病情，及时发现问题，科学规范诊治，必要时进行合理转诊，可以让患者免去非必要的舟车劳顿，获得更好的就医体验。

3．清晰的处理流程思路对检验工作中遇到的异常结果有很大帮助。生化部分项目属于非特异性反应，常见干扰现象。因此，遇到特殊情况时，需严谨有序的进行排查，具备一定的专业知识和临床思维能助于我们更好的解决问题。在实际工作中多观察思考，丰富自己的临床知识，而不仅仅满足于发出一张检验报告，做到知其然而知其所以然，才能更好地服务患者。

知识拓展

就此案例而言，探究负值问题，最基本的是先掌握仪器检测出的结果是如何计算出来的，再结合反应曲线的特点，逐一排查分析，从而破解疑问。

生化仪是采用光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器，按方法分为透射法和散射法，大部分生化仪主要为前者。测试方法分终点法和速率法两大类。常见的异常反应曲线类型大致有：

1)正常情况，从加入R1试剂到样本和加入样本到R2试剂的曲线段应为平直、无跳点状态。若出现吸光度小幅变化，超出试剂说明书的空白吸光度值，需考虑试剂有无变质。

2)抖动的曲线可见于加入样本后，搅拌系统工作异常导致搅拌不充分、样本脂血所致。或是采样针存在微堵情况。光源灯不稳定也会有现象。

3)低值吸光度，结果整体偏低，反应曲线形状大致正常，则需考虑采样针堵塞较严重了。

4)若副波长也抬高明显，多为一些药物影响和高浓度免疫球蛋白，如IgM。

5)速率法的曲线中看到了终点法的曲线走势，无疑，需要考虑底物耗尽了。

下面以在用的迈瑞BS830生化为例，用比较易懂的葡萄糖项目（终点法）来说明：

葡萄糖（GLU）检测时涉及到的一些关键词和定义：葡萄糖氧化酶法、双试剂、两点终点法、上升反应。N、P为空白时间，L、M为反应时间（图11-14）

（图11-14）

1．反应时间内吸光度（迈瑞仪器为反应度，意思相同）：GLU用于计算反应时间内的代表的吸光度符合L=M-2的3个采光点设置。用于计算的吸光度为舍去最大值和最小值后的值。

如图可知：检测的采光点和对应的反应度（31：2538.77）、（32：2566.90）、（33：2590.77），用于计算的为（32：2566.90）。试剂样本空白：（14：78.45）、（15：80.28）、（16：79.29），用于计算的为（16：79.29）。

2．体积校正因子：GLU的空白时间符合5≤N≤P≤16，反应时间符合18≤L≤M≤33，故体积校正因子为K2=（VR1+VS)/（VR1+VS+VR2)，其中VR1和VR2为第一、二试剂的体积；VS为实际所加样本体积。

如图可知：K2=（VR1+VS)/（VR1+VS+VR2)=（200+2.5)/（200+2.5+50)≈0.801980

3．终点法吸光度计算：R=Ai-（K*Ab），在这里K为K2，Ai为主副波长之差，Ab为（R1+S）的试剂样本空白吸光度。浓度计算公式C=K*（R-R0），此K为校准斜率，R0为校准水空白。

如图可知：

最终反应度为：R=2566.90-0.801980*79.29=2503.311006≈2503.3

校准K值：K=C/（R-R0）=10.80/（6218.6-49.8088）≈0.001751

GLU检测结果为：C=K*（R-R0）=0.001751*（2503.3-49.8088）=4.296063≈4.30

备注：

双波长测试，吸光度A为主副波长的吸光度之差。单波长测试,A为主波长吸光度。

单试剂终点法的空白校正值取加入样本前的一个采光点。

下降反应（负反应）中，吸光度=终点吸光度-(-试剂样本空白值）。

按浓度计算公式C=K*（R-R0），计算出具体的校准K值（仪器校准界面的K值实为约数结果，用此K值计算浓度与仪器结果会出现偏差现象），校准K=C/（R-R0）；R为吸光度，R0为同批次试剂校准时的水空白）

速率法浓度计算：

a.确定线性范围（依据仪器使用说明书）；

b.通过各测试点时间（维修手册可查）和吸光度值（反应曲线数据可查），利用最小二乘法（excel表格作图法）计算出线性方程式，得出反应时间段的吸光度变化率(y=kx+b中的K）。同理可得空白时间段的吸光度。再根据项目的体积校正因子，计算出最终反应度。

c.根据浓度公式计算出结果。

点   评

余高平：佛山市顺德区乐从医院检验科生化组组长 副主任技师

本案例问题的圆满解决，充分体现了作者认真负责的工作态度、严谨细致的逻辑思维和丰富扎实的临床知识。案例由项目反应曲线的异常引起，涉及知识点本身属于生化组成员的基本要求，但实际上由于大部分生化反应属于非特异性反应，影响因素复杂，异常情况的排查和处理通常比较棘手，尤其对新入职的同事来说。所幸本案例的作者能抓住细微处的变化最终找到原因，为患者的下一步诊治提供依据。

参考文献：

[1] 钱芳, 陈玉 .羟苯磺酸钙药物浓度对肌氨酸氧化酶法检测肌酐的干扰试验分析[J].检验医学与临床,2022, 19(6):843-844.

[2] 王正印,尹元,王伟灵.肌酐检测方法及常见药物对肌酐检测干扰的研究进展[J].检验医学,2018,33(4):370-373.

[3] 王淼,池罗,陈莹,王欣,王秀凤,温冠辉,曹新贞,宋世平.华氏巨球蛋白血症患者血清高IgM对肌酐检测干扰的评析[J]. 国际检验医学杂志,2018,39(4):511-512.

[4] 白志瑶,包艳,戴宏斌,等. 高免疫球蛋白血症多发性骨髓瘤临床与实验室综合分析[J]. 实用检验医师杂志,2019,11(4):227-230. DOI:10.3969/j.issn.1674-7151.2019.04.011.

[5] 汤菲,安黎云,贾克然,等.湿化学酶法测定华氏巨球蛋白血症患者血清肌酐假性增高的评析[J].国际检验医学杂志, 2015, 36(8):2.DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.08.025.

[6] 贾芳苗.用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法及从血浆中分离免疫球蛋白的方法:CN111333718A[P].2020-06-26..

[7] CNAS-GL037-2019《临床化学定量检验程序性能验证指南》

[8] 高阳.反应曲线在临床生化检验中的应用研究[J].中国卫生产业,2015, 12(27):115- 117.

作者：廖细珊 佛山市顺德区乐从社区卫生服务中心检验科

余高平 佛山市顺德区乐从医院检验科

编辑：熊熊