PCR实验室污染的防控及消除

截止2020年底所有二级以上综合医院都具备了核酸检测能力，大部分医院也设立了PCR实验室，正常情况下，高强度的核酸检测任务已然成为了我们检验人的工作常态化，但是，如果一旦出现实验室污染，可能会造成假阳性结果，导致结果不可信，工作就会被迫打断，处理起来也比较棘手，所以，应对PCR实验室的污染的最好办法就是防范于未然，今天就带大家了解一下实验中我们如何才能避免和减少污染的产生。

一、各区工作注意事项：

1、试剂储存和准备区。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本制备区；

2、标本制备区。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序；

3、扩增区。为避免气溶胶所致的污染，应当尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开；

4、扩增产物分析区。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。废液及用过的吸头必须收集至1 mol/L HCl中，不能在实验室内倾倒，浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护；

5、注意物品流向，依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行；

6、试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品应专用，并设置不同的标识、颜色等予以区分。

二、规范化的实验设置

应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照，全程质控实验过程，验证PCR反应的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。

三 、实验操作小贴士

1、实验应在超净工作台或者生物安全柜内进行；

2、实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区交叉污染；

3、装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染；需要高温加热的样本，可采用封口膜进行PCR管盖密封，避免管盖应受热而发生弹开；

4、吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染；

5、PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数和反复使用过程中的试剂污染；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸，请勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作；

6、实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处；

7、PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套或者塑封袋将产物反应管包裹丢弃，保证管盖紧闭；

8、实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌，枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。

四、坚持常规清洁工作

实验结束后应该对操作台面，仪器，实验用具及环境进行清洁，这对污染的控制尤为重要。

1、实验后所有的试剂按照要求进行存放，废料和废液及时清理，避免存放过多和过久，废液缸用有效氯含量为2000mg/L消毒水浸泡消除核酸污染；

2、离心管架、试管架等可重复使用的物品浸泡到500mg/L 的消毒液中过夜，第二天用清水清洗后晾干使用；

3、对各区的生物安全柜、洁净工作台先用75%酒精或者500mg/L 的消毒液擦拭后采用紫外灯进行消毒处理；

4、配制含有效氯500mg/L 的消毒液对设备表面、台面、地面、物品表面、传递窗内及门窗进行擦拭，再用纯化水对设备表面、台面、进行擦拭，避免消毒液对实验器具的腐蚀，仪器如核酸提取仪采用内部紫外消毒程序进行照射；

5、操作台面使用移动紫外消毒车近距离辐照1小时，应使灯管距离工作区的距离在60-90cm；实验室内则使用室内紫外灯整晚辐照。

五、消除污染的操作步骤

1、清理废液缸并且对废液缸用有效氯含量为 2000mg/L 消毒水浸泡消除核酸污染；

2、用有效氯含量为 2000mg/L 消毒水对移液枪进行擦洗，关键部位为移液枪前端易污染部位，清洁干净后用洁净水再擦拭一遍；

3、将离心管架、扩增管架、扩增管架底板、吸嘴盒及其他相关物品用有效氯含量为 500mg/L 的消毒水浸泡 2 小时后，用清水冲洗干净晾干后使用；

4、对污染区域内的设备如扩增仪、全自动提取仪等，使用核酸气溶胶污染清除剂进行反复处理；对生物安全柜等含有空气过滤系统的设备，需更换过滤网；

5、用有效氯含量为 500mg/L 的消毒液对整个实验室（地板、墙面、天花板、门、窗户等地方）进行清洁，并且用用有效氯含量为 1000mg/L 的消毒水对实验室进行喷雾消毒(重点部位为操作区)，有效降解空气中的气溶胶与附着在实验台表面的核酸污染；同时加大通风量（内循环无用，尽可能外循环）；

6、待污染区域及设备器件清理完成后，常用设备和操作台面使用移动紫外消毒车近距离辐照1小时；实验室内则使用室内紫外灯整晚辐照。

步骤1- 6 必须坚持每天进行，确保消除实验室污染；

污染消除判断标准

设计阴性对照组，根据阴性对照确认污染情况。可使用敞开后隔夜放置操作区的阴性对照进行实验（在单独的实验室验证），若连续三天阴性对照没有起跳，则说明污染得到控制，可恢复正常实验。